PCR技術(shù)操作流程

一、PCR 的基本原理

類(lèi)似于 DNA 的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增 DNA 模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在 DNA 聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性 - 復(fù)性 - 延伸的過(guò)程就是一個(gè) PCR 循環(huán)，PCR 就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。

二、PCR 反應(yīng)體系

1. 緩沖液

標(biāo)準(zhǔn)的緩沖液含 1pmol/ml Tris ·HCl，其 pH 為 8.3-9.0（室溫），而在延伸溫度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。緩沖液中含有一種二價(jià)陽(yáng)離子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+。

2.dNTP

脫氧核糖核苷三磷酸的縮寫(xiě)，是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在內(nèi)的統(tǒng)稱(chēng)，即合成新的 DNA 鏈的材料。4 種 dNTP 的濃度相等，總濃度一般為 200pmol/ml （即飽和濃度）。dNTP 可與 Mg2+ 結(jié)合，使游離的 Mg2+ 濃度下降，影響 DNA 聚合酶的活性。

3. 引物

引物是一段短的單鏈 DNA 片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，DNA 聚合酶可由其 3′端開(kāi)始合成新的核酸鏈。引物長(zhǎng)度一般以 18～30bp 為宜，過(guò)短則降低特異性，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起引物間的退火而影響有效擴(kuò)增，同時(shí)也增加引物合成的成本。引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。

4. 模板

模板是一段單鏈或者雙鏈 DNA，提供用于進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增的原始信息。對(duì)模板的純度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制劑、DNA 結(jié)合蛋白等。模板 DNA 應(yīng)該盡量保持低溫保存。

5.Taq DNA 聚合酶

Taq DNA 聚合酶以 DNA 為復(fù)制模板，從將 DNA 由 5' 端點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具備模板、引物、dNTP 等的情況下）及其相輔的活性。必須一直保存于－20℃，內(nèi)含甘油保存。最適反應(yīng)溫度 72 ℃，即延伸溫度。通常在配制 PCR 體系的最后加入。