實驗目的

掌握細胞計數(shù)的方法。

了解區(qū)分細胞存活狀態(tài)的方法。

實驗用品

0.4%臺盼藍溶液、無水乙醇或95%乙醇溶液、脫脂棉

普通顯微鏡、試管、吸管、毛細吸管、細胞計數(shù)板、綢布。

實驗原理

在細胞培養(yǎng)工作中，常需要了解細胞生活狀態(tài)和鑒別細胞死活，確定細胞接種濃度和數(shù)量以及了解細胞存活率和增殖度，如用酶消化制備的細胞懸液中細胞活力的鑒別，凍存細胞復蘇后的活力檢測等。細胞懸液制備后，常用活體染料臺盼藍對細胞進行染色，進行細胞計數(shù)。臺盼藍不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色。而死亡細胞的細胞膜通透性增高，可使染料進入細胞內(nèi)而使細胞著色（藍色）。細胞計數(shù)一般用血細胞計數(shù)板，按白細胞計數(shù)方法進行計數(shù)，便于確定細胞的生活狀況。

實驗內(nèi)容與方法

（一）制備動物細胞懸液

 將動物細胞用生物鹽水制備成適當濃度的細胞懸液備用。

（二）細胞計數(shù)

1. 計數(shù)板處理

用無水乙醇或95%乙醇溶液擦拭計數(shù)板后，用綢布擦凈，另擦凈蓋玻片一張，把蓋片覆在計數(shù)板上面。

2. 染色

用滴管吸取0.4%臺盼藍染液，按1∶1比例加入細胞懸液中。從計數(shù)板邊緣緩緩滴入，使之充滿計數(shù)板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡，否則要重做。稍候片刻，將計數(shù)板放在低倍鏡下（10×10倍）觀察計數(shù)。

3. 計數(shù)方法

按圖計算計數(shù)板的四角大方格（每個大方格又分16個小方格）內(nèi)的細胞數(shù)。計數(shù)時，只計數(shù)完整的細胞，若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數(shù)。在一個大方格中，如果有細胞位于線上，一般計下線細胞不計上線細胞，計左線細胞不計右線細胞。二次重復計數(shù)誤差不應超過±5%（圖7-1）。鏡下觀察，凡折光性強而不著色者為活細胞，染上藍色者為死細胞。

4. 計數(shù)的換算

計完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為0.01 cm2，高為0.01 cm，這樣它的體積為0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1 ml＝1000 mm3，所以每一大方格內(nèi)細胞數(shù)×10 000＝細胞數(shù)/ml，故可按下式計算：

細胞懸液細胞數(shù)/ml＝4個大格細胞總數(shù)/4×10 000

如計數(shù)前已稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。

計數(shù)細胞后，計算細胞懸液濃度并求出存活與死亡細胞數(shù)的比例。

注意事項：

向計數(shù)板中滴細胞懸液時要干凈利落，加量要適當，過多易使蓋片漂移，或淹過蓋片則失敗，需重做，過少易出現(xiàn)氣泡；不理想時，應重做；