細(xì)胞培養(yǎng)是生物醫(yī)學(xué)研究中的基礎(chǔ)技術(shù)之一，但在實(shí)際操作中，常常會(huì)遇到各種問題。以下將結(jié)合我搜索到的資料，詳細(xì)列舉細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的問題及其解決辦法。

1. 培養(yǎng)液pH值變化過快

原因：CO?張力不正確、瓶蓋過緊、碳酸氫鹽緩沖不足、鹽濃度不正確或細(xì)菌/真菌污染。

解決辦法：調(diào)整CO?濃度、松開瓶蓋1/4圈、增加HEPES緩沖液濃度、使用正確的鹽和培養(yǎng)基、丟棄污染的培養(yǎng)物并嘗試凈化。

2. 培養(yǎng)液中出現(xiàn)沉淀

原因：殘留磷酸鹽、冰凍保存導(dǎo)致沉淀、細(xì)菌/真菌污染。

解決辦法：用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿并除菌，或加熱培養(yǎng)液至37℃并搖動(dòng)使其溶解，若沉淀仍存在則丟棄培養(yǎng)液。

3. 細(xì)胞不貼壁

原因：胰蛋白酶消化過度、支原體污染、培養(yǎng)液中缺乏貼壁因子。

解決辦法：縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低濃度、清潔支架或培養(yǎng)箱、調(diào)整培養(yǎng)液成分。

4. 懸浮細(xì)胞成簇

原因：培養(yǎng)液中鈣、鎂離子含量高、支原體污染、蛋白酶過度消化。

解決辦法：使用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞、分離培養(yǎng)物并檢測支原體、用DNase I處理細(xì)胞。

5. 細(xì)胞生長緩慢

原因：培養(yǎng)基配方不當(dāng)、血清質(zhì)量差、細(xì)胞傳代次數(shù)過多、細(xì)胞老化、支原體污染。

解決辦法：更換新鮮培養(yǎng)基、補(bǔ)充谷氨酰胺及生長因子、使用無抗生素培養(yǎng)液、增加接種細(xì)胞濃度、換用新的保種細(xì)胞。

6. 細(xì)胞死亡

原因：培養(yǎng)箱內(nèi)無CO?、溫度波動(dòng)大、細(xì)胞損傷、培養(yǎng)液滲透壓不正確、有毒代謝產(chǎn)物堆積。

解決辦法：檢測并調(diào)整培養(yǎng)箱內(nèi)CO?和溫度、更換保存細(xì)胞種、檢測培養(yǎng)液滲透壓、換入新鮮培養(yǎng)液。

7. 細(xì)胞污染

原因：細(xì)菌、真菌、支原體或病毒污染。

解決辦法：丟棄被污染的細(xì)胞并消毒培養(yǎng)環(huán)境、使用優(yōu)質(zhì)血清、避免反復(fù)凍融。

8. 細(xì)胞復(fù)蘇后無活細(xì)胞

原因：細(xì)胞凍存不當(dāng)、復(fù)蘇方法不當(dāng)、復(fù)蘇培養(yǎng)基不合適、細(xì)胞稀釋過度。

解決辦法：新取一只凍存細(xì)胞并儲(chǔ)存在液氮中、按照供應(yīng)商推薦的操作程序凍存細(xì)胞、使用供應(yīng)商推薦的培養(yǎng)基、避免渦旋振蕩或用力敲打培養(yǎng)瓶

9. 細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁不良

原因：低濕度導(dǎo)致靜電積累、消化過度、支原體污染。

解決辦法：增加室溫濕度、使用防靜電裝置、調(diào)整消化條件、檢測并清除支原體。

10. 細(xì)胞生長不均勻

原因：細(xì)胞或培養(yǎng)基混合不足、沖擊式細(xì)胞生長不均、培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)。

解決辦法：插入細(xì)胞后輕輕搖晃混合、使用搖床時(shí)保持連續(xù)穩(wěn)定的振幅和頻率、調(diào)整培養(yǎng)箱溫度。

11. 細(xì)胞形態(tài)異常

原因：消化過度、培養(yǎng)基成分改變、長期繼代篩選結(jié)果。

解決辦法：調(diào)整消化時(shí)間、更換培養(yǎng)基、觀察細(xì)胞狀態(tài)。

12. 細(xì)胞凍存不當(dāng)

原因：凍存液質(zhì)量差、凍存方法不當(dāng)、存儲(chǔ)不當(dāng)、解凍方法不當(dāng)。

解決辦法：遵循供應(yīng)商建議的緩慢冷凍、使用合適的細(xì)胞保護(hù)劑、快速解凍并使用預(yù)熱培養(yǎng)基。

13. 血清保存與使用問題

原因：血清保存不當(dāng)、血清解凍方法不當(dāng)、熱滅活血清影響質(zhì)量。

解決辦法：建議在-5℃至-20℃保存，避免4℃超過一個(gè)月，分裝后冷凍；逐步解凍，均勻搖晃，避免長時(shí)間置于37℃。

14. 細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活率問題

原因：細(xì)胞計(jì)數(shù)方法不準(zhǔn)確、DMSO毒性、滲透壓傷害。

解決辦法：使用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞、立即去除DMSO、預(yù)熱培養(yǎng)基、快速解凍。

15. 細(xì)胞傳代操作不當(dāng)

原因：消化過度、傳代比例錯(cuò)誤、離心過度。

解決辦法：控制消化時(shí)間、調(diào)整傳代密度、輕柔操作