PCR 假陰性（無擴(kuò)增條帶）快速排查清單（實(shí)驗(yàn)室直接可用）

第一步：先看 3 個(gè)對照，定位大方向

陽性對照：無條帶 → 試劑、程序、儀器、配體系問題

陰性對照：無條帶 → 無污染，可排除污染干擾

樣本孔：wei獨(dú)樣本無條帶 → 模板本身問題（降解 / 濃度低 / 有抑制物）

第二步：試劑與體系排查（對照無條帶優(yōu)先查）

 Taq 酶是否過期、是否室溫放置失活

 是否漏加：酶、Buffer、Mg2?、dNTP、引物

 Mg2?濃度是否偏低

 試劑是否反復(fù)凍融、反復(fù)開蓋污染

 體系配制是否在冰上操作

第三步：引物排查

 引物是否過期、降解、稀釋后久放

 退火溫度是否過高（最易不出條帶）

 引物有無發(fā)夾、二聚體、與模板不匹配

 更換新引物重試

第四步：模板核酸排查（樣本無條帶重點(diǎn)查）

 核酸是否降解（反復(fù)凍融、放置過久）

 模板濃度過低、上樣量太少

 樣本含抑制物：酚、乙醇、高鹽、血紅蛋白、肝素等

 處理方式：模板1:5~1:10 稀釋后重?cái)U(kuò)

 重新提取新鮮核酸

第五步：PCR 擴(kuò)增程序 & 儀器

 退火溫度偏高 → 做溫度梯度下調(diào)摸索

 起始變性溫度 / 時(shí)間不足，雙鏈未解鏈

 儀器孔位溫度漂移，換孔 / 換儀器驗(yàn)證

第六步：電泳及人為操作

 瓊脂糖凝膠濃度配制錯(cuò)誤

 電泳時(shí)間、電壓不合適

 核酸染色不充分、上樣量過少

 加樣順序錯(cuò)誤、交叉污染、配體系算錯(cuò)體積

第七步：標(biāo)準(zhǔn)解決操作流程

先跑陽性對照，區(qū)分試劑問題還是模板問題

退火溫度做梯度 PCR

樣本模板稀釋后重新擴(kuò)增

換新酶、新引物、重新提核酸

核對 PCR 程序參數(shù)，必要時(shí)微調(diào)變性、退火時(shí)間