PBCV DNA連接酶試劑也稱(chēng)為SplintR 連接酶或 Chorella 病毒 DNA 連接酶，它能夠高效催化相鄰的 DNA 核苷酸的連接，

這個(gè)連接過(guò)程需要一條互補(bǔ)的 RNA 在兩條 DNA 單鏈間起“夾板"或“橋梁"的固定作用。PBCV DNA連接酶的這種活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)

優(yōu)于傳統(tǒng)的T4 DNA連接酶，有助于miRNAs和mRNAs，包括SNPs在內(nèi)的研究方法的創(chuàng)新。另外，在二代測(cè)序和分子診斷等

眾多領(lǐng)域中，PBCV DNA連接酶是富集目的基因的理想選擇。它具有穩(wěn)定的生物活性，對(duì) RNA 介導(dǎo)固定的 DNA 底物親和性強(qiáng)

（米氏常數(shù) Km = 1 nM），能夠在復(fù)雜的混合物中檢測(cè)到亞納摩爾級(jí)的特定 RNA。因此，在 RNA 檢測(cè)技術(shù)中，PBCV DNA 

連接酶不失為很好選擇用酶。組分

組分名稱(chēng)數(shù)量

PBCV DNA Ligase(25 U/μl)50μl

10×PBCV Ligase Buffer250μl

活性定義

25°C反應(yīng)30分鐘條件下，使1pmol的DNA:RNA雜交底物連接所需要的酶量定義為1Unit。

反應(yīng)溫度及失活

該酶的最佳反應(yīng)溫度為25度，可在16-37度之間優(yōu)化，37度可明顯提高反應(yīng)的特異性；該酶在65°C 加熱20min即可失活。

儲(chǔ)存

-20℃可保存3年。

使用注意事項(xiàng)

1. 該酶對(duì)一價(jià)陽(yáng)離子非常敏感，如NaCl或KCl的濃度應(yīng)低于50mM。

2. 該酶的反應(yīng)溫度為16~37℃，隨著溫度的上升酶活性會(huì)提高，但此時(shí)腺苷化產(chǎn)物也隨之增加，最佳溫度為25 ℃。

3. 連接效率隨著夾板RNA長(zhǎng)度的減少而降低，當(dāng)長(zhǎng)度小于等于10nt時(shí)，連接效率為零。

PBCV DNA連接酶試劑恒溫?cái)U(kuò)增使用策略及實(shí)例展示

應(yīng)用實(shí)例1：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈨x上進(jìn)行反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測(cè)結(jié)果，可以看到檢測(cè)反應(yīng)<20min(達(dá)平臺(tái)期)。

應(yīng)用實(shí)例2： 用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試。OG變色法為終點(diǎn)變色策略，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，溶解管蓋上染料后，陽(yáng)性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類(lèi)型限制，雜質(zhì)耐受性很好。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測(cè)結(jié)果。

應(yīng)用實(shí)例3：A3825-01 紅黃變色反應(yīng)（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起

始前，下圖為 65 度反應(yīng) 30min 后。

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